Laboratoře transplantační medicíny

Laboratoř transplantační medicíny byla nově zřízena od 1.1.2025. Jejím posláním je zastřešit laboratorní vyšetření prováděná v ÚHKT pro transplantace hematopoetických kmenových buněk (HSCT – hematopoietic stem cell transplantation). Cílem laboratoře je koordinovat jednotlivá vyšetření tak, aby byl zajištěn maximální přínos pro transplantované pacienty.

Zástupci laboratoře se aktivně účastní klinických seminářů zabývajících se výběrem vhodných dárců krvetvorných kmenových buněk pro konkrétní pacienty.

Laboratoř transplantační medicíny je tvořena Oddělením HLA, Oddělením buněčného chimerizmu a Laboratoří HLA serologie.

Oddělení HLA provádí specializovaná imunogenetická vyšetření pacientů indikovaných k transplantaci hematopoetických kmenových buněk, jejich příbuzných a vybraných nepříbuzných dárců s cílem nalezení nejvhodnějšího dárce pro transplantaci.

Při vyšetření pacientů a při vyhledávání vhodných dárců je testován hlavní imunitní systém člověka – HLA (Human Leukocyte Antigens) na úrovni vysokého rozlišení s využitím vysoce přesné metody masivně paralelního sekvenování. 

Nejvhodnějším dárce z imunologického úhlu pohledu je HLA shodný sourozenec. Pokud pacient nemá shodného sourozence, jsou na základě provedené genotypizace vybráni potenciálně vhodní dárci v registrech nepříbuzných dárců, kteří jsou na oddělení dotestováni a je stanovena jejich míra shody s pacientem. Cílem je nalezení dárce s co největší mírou shody v HLA.  Další možností je využití tzv. haploidentické transplantace, kdy pacient s dárcem sdílí pouze jednu polovinu HLA znaků (jeden haplotyp). Pro tento typ transplantace jsou dárci vyhledáváni mezi přímými příbuznými (sourozenci, rodiče a děti pacienta). Ve výjimečných případech je možné využít i vzdálenější příbuzné.

Oddělení buněčného chimerizmu provádí analýzu DNA pacienta před transplantací a DNA jeho vybraného dárce. Cílem je identifikovat rozdíly v nekódujících sekvencích DNA, které umožní rozlišení obou genetických profilů ve směsi po transplantaci a následnou kvantifikaci jejich zastoupení.

Hlavním cílem vyšetření buněčného chimerizmu je dlouhodobé sledování potransplantačního průběhu, zejména dynamiky přihojení štěpu a včasné detekce návratu původní krvetvorby, která může signalizovat riziko relapsu hematoonkologického onemocnění. Vyšetření buněčného chimerizmu se standardně provádí z periferní krve nebo kostní dřeně. V případě potřeby je dostupné také pro specifické buněčné subpopulace periferní krve, což umožňuje cílenější monitoraci transplantovaného štěpu. 

Oddělení buněčného chimerizmu každoročně organizuje externí porovnávání zkoušek.

Laboratoř HLA serologie se v rámci Oddělení imunohematologie zabývá zejména detekcí a identifikací protilátek HLA I. a II. třídy, které jsou vyšetřovány vysoce senzitivními testy pevné fáze pomocí multiplexních imunoanalyzátorů (přístrojů typu Luminex). Vyšetření HLA protilátek pomocí screeningových a identifikačních testů pevné fáze je indikováno všem pacientům před alogenní transplantací krvetvorných kmenových buněk (HSCT) s příbuznými i nepříbuznými potenciálními dárci v rámci výběru co nejvhodnějšího dárce pro pacienta a dále v rámci personalizované transfuzní terapie pacientů před i po HSCT. 

Rozsah služeb:

Vyšetření prováděná před transplantací hematopoetických kmenových buněk:

HLA genotypizace pacientů, příbuzných a vybraných nepříbuzných dárců 
(provádí Oddělení HLA)

Po indikaci k transplantaci je u pacienta provedena genotypizace HLA na úrovni vysokého rozlišení v lokusech HLA I. a II. třídy. Stejná HLA typizace je provedena u všech sourozenců, kteří jsou ze zdravotního pohledu schopni dárcovství kmenových buněk. Testování vybraných nepříbuzných a dalších příbuzných dárců je prováděno stejnými metodami na základě dohody s transplantačními specialisty.

Stanovení HLA kompatibility mezi dárcem a příjemcem
(provádí Oddělení HLA)

Na základě testů HLA popsaných výše je stanovena míra shody mezi pacientem a jeho dárci.

Screening a identifikace HLA protilátek
(provádí Laboratoř HLA serologie)

Cílem vyšetření je detekovat, popř. určit specifitu HLA protilátek pacienta proti případným neshodným HLA antigenům potenciálního dárce (donor specifické protilátky). Jelikož pacienti s donor specifickými protilátkami (DSA) mají zvýšené riziko odhojení (rejekce) transplantovaného štěpu, opožděného přihojení štěpu a nižší úspěšnosti transplantace, jsou případné HLA protilátky pacienta průběžně monitorovány s cílem vybrat dárce bez HLA antigenů korespondujících s donor specifickými protilátkami pacienta. Při nedostupnosti dárce krvetvorných kmenových buněk bez HLA antigenů, proti nimž má pacient donor specifické HLA protilátky, je na základě vyšetření HLA protilátek zvážena strategie případné desenzitizační terapie pacienta, která obvykle vede k redukci či odstranění donor specifických protilátek z oběhu pacienta, a tím snižuje riziko rejekce štěpu a dalších potransplantačních komplikací. 

Screeningový test pevné fáze (Luminex) s afinitně purifikovanými nativními i rekombinantními HLA antigeny detekuje přítomnost protilátek HLA I. a II. třídy, včetně protilátek proti HLA antigenům lokusu DP, což je důležité zejména u pacientů s nepříbuznými dárci z registru s HLA shodou 10/10, kdy dárce může mít vůči pacientovi neshodné antigeny v lokusu DP. Výsledek screeningového testu je dále doplněn o identifikační testy pevné fáze (Luminex) s jednotlivě vázanými typy HLA antigenů, pomocí nichž je určena specifita případných HLA protilátek I. a II. třídy. 

Lymfocytotoxický crossmatch
(provádí Laboratoř HLA serologie)

Reakce komplement aktivujících HLA protilátek pacienta s neshodnými HLA antigeny konkrétního dárce se vyšetřuje pomocí lymfocytotoxického crossmatch testu u pacientů indikovaných k transplantaci hematopoetických kmenových buněk s příbuzným potenciálním dárcem a dále před podáním transfuzního přípravku (nejčastěji trombocytů, eventuálně granulocytů či erytrocytů) k minimalizaci rizika potransfuzních reakcí a krvácivých stavů z důvodu refrakternosti na podání trombocytů.

Stratifikace imunologického rizika jednotlivých dárců
(provádí Laboratoř HLA serologie ve spolupráci s Oddělením HLA)

 Profil jednotlivých specifit HLA protilátek I. a II. třídy je porovnán s HLA genotypizací potenciálních dárců pro pacienta v lokusech A, B, C, DRB1, DQB1, DQA1, DPB1, v případě potřeby i lokusech DPA1, DRB3, DRB4 a DRB5, s důrazem na výskyt případných donor specifických protilátek (DSA) proti HLA neshodným antigenům dárce. V případě výskytu DSA u pacienta je dále doplněno vyšetření HLA protilátek aktivujících komplement (složku C3d) pomocí tesů pevné fáze (Luminex) s jednotlivými typy HLA antigenů, což umožňuje individuální přístup při managementu desenzitizačního protokolu u pacientů s DSA.

Vyšetření prováděná po transplantaci hematopoetických kmenových buněk:

Vyšetření buněčného chimerizmu po alogenní HSCT 
(provádí Oddělení buněčného chimerizmu)

Vyšetření buněčného chimerizmu je založeno na genotypizaci a kvantifikaci variabilních polymorfizmů, konkrétně krátkých tandemových repetic (STR) a krátkých delecí a inzercí (indel), které se nacházejí v nekódujících oblastech DNA. Tyto genetické markery slouží k identifikaci jednotlivých buněčných populací ve vzorku a následnému kvantitativnímu stanovení jejich zastoupení.

K analýze buněčného chimerizmu se využívají moderní molekulárně-biologické metody, jako je polymerázová řetězová reakce s fragmentační analýzou, která umožňuje detekci minoritních populací s citlivostí až 1 %, a real-time PCR (qPCR), dosahující citlivosti až 0,035 %. Tyto technologie umožňují přesné a spolehlivé sledování chimerizmu a poskytují důležité informace pro klinické rozhodování v rámci transplantační péče.

Detekce HLA-loss relapsu 
(provádí Oddělení buněčného chimerizmu ve spolupráci s Oddělením HLA)

Při nárůstu chimerizmu v non-HLA markerech u pacientů po haploidentické transplantaci je možné vyšetřit, zda nedošlo ke ztrátě HLA neshodného haplotypu pacienta, tedy HLA-loss relapsu. Toto vyšetření se provádí kvantifikací HLA markerů specifických pro pacienta pomocí real-time PCR (zajišťuje Oddělení buněčného chimerizmu). V případě, že není HLA marker k dispozici, je možné kvantifikovat HLA specifické pro pacienta pomocí NGS (zajišťuje Oddělení HLA).   

Toto vyšetření je zásadní pro určení následné strategie léčby. V případě HLA-loss relapsu je standardní podání dárcovských T-lymfocytů neefektivní, což vyžaduje odlišný přístup k léčbě než u klasického relapsu.