Menu
Laboratoře

Kvantifikace WT1 a NPM1

SOP 02: Stanovení množství transkriptů genu WT1 pomocí real-time RT-PCR u pacientů s akutními leukémiemi a MDS

V periferní krvi zdravých osob je gen WT1 exprimován na velmi nízké hladině (< 50 kopií) a je často nedetekovatelný sensitivními metodami, jako je RT-PCR. Vyšší expresi nacházíme u vzorků získaných aspirací kostní dřeně zdravých dárců. Avšak gen WT1 je vysoce overexprimován v blastech pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML) a v raných stadiích CD34 pozitivních buněk. Podobně nárůst exprese genu WT1 u MDS v čase signalizuje transformaci do akutní leukémie.

U více než 90% leukemických buněk (a to speciálně těch s myeloidním charakterem) nacházíme hladinu exprese o 2 – 3 řády vyšší než v kostní dřeni či periferní krvi zdravého dárce. Výjimkou jsou některé AML FAB subtypů M5-M7 a rovněž AML s některými přestavbami genu MLL. Některé publikace poukazují na korelaci vysoké hladiny exprese genu WT1 při diagnóze a horší prognózu. Dále řada studií ukazuje, že hladina exprese genu WT1 v periferní krvi hraje důležitou roli v patogenezi leukémie a dle sledování dynamiky poklesu respektive dosažení či nedosažení normálních hodnot můžeme posoudit/určit odpověď pacienta na léčbu. K efektivnímu monitorování minimální zbytkové nemoci lze tedy použít sledování exprese genu WT1 a to i u těch pacientů, kteří nemají jiný specifický markér - fúzní gen; tj. u cca 70% akutních myeloidních leukémií. Řada klinických studií dokázala vysoce signifikantní korelaci exprese specifických leukemických markérů s expresí genu WT1. Sledování exprese genu WT1 je vhodným molekulárním markérem úspěšnosti léčby, který nám umožňuje sledovat dosažení hodnot exprese genu WT1, které nacházíme u zdravých dárců. Přetrvávání zvýšené exprese genu WT1 po ukončení léčby je spojeno se zvýšeným rizikem relapsu onemocnění. Analogicky u pacientů v remisi (s expresí genu WT1 na úrovni exprese u zdravých dárců) nárůst exprese genu WT1 nad hodnoty nacházené u zdravých dárců signalizuje nadcházející relaps s předstihem až jednoho měsíce. Nezanedbatelným faktem je větší dynamické rozmezí sledování hladiny transkriptu WT1 v buňkách periferní krve ve srovnání se stavem v buňkách kostní dřeně. Zároveň odběr periferní krve je méně zatěžující pro pacienta. Nově jsme zjistili, že exprese genu WT1 před transplantací kostní dřeně má prognostický význam – overexprese (tj. nad 50 kopií genu WT1/104 kopií ABL) je spojena s horším přežitím a s vyšší kumulativní incidencí relapsů.

Souhrnně kvantitativní určení exprese genu WT1 přispívá k posouzení prognózy onemocnění a k časné předpovědi nadcházejícího klinického relapsu.

Exprese genu WT1 u ALL (akutní lymfoblastická leukemie): Gen WT1 je rovněž zvýšeně exprimován u cca 90% pacientů s ALL ale medián jeho exprese je signifikantně nižší ve srovnání s mediánem exprese genu WT1 u akutní myeloidní leukémie. Dále je zde pozorována velká variabilita exprese genu WT1 u jednotlivých subskupin ALL s nejnižší expresí u zralých B-ALL a s nejvyšší expresí genu WT1 u ALL s koexpresí myeloidních markérů.

Exprese genu WT1 má rovněž klinický význam u pacientů s MDS (myelodysplastický syndrom), kde je zejména markérem progrese do akutní leukémie. V této publikaci je navržena „cut-off" hladina exprese (1000 kopií genu WT1 na 10000 kopií genu ABL ve vzorcích z kostní dřeně), která umožní rozlišit mezi „intermediate-low risk" a „intermediate-high risk" subskupinami MDS. Tato hladina by ve vzorcích z periferní krve odpovídala hladině exprese 200 kopií genu WT1 na 10000 kopií genu ABL. Při suspektní AML velmi vysoká exprese genu WT1 ukazuje na potvrzení diagnózy AML. Pacienti s CLL naopak neexprimují gen WT1 ve zvýšené hladině, jak bylo zjištěno na velmi malém počtu pacientů (n = 3) s CLL zadaných k vyšetření NRL.

Na základě doporučení European Leukemia Net byla jako nejlepší metoda real-time RT-PCR vybrána metoda RQ-PCR WT1 s kontrolním genem ABL (Abelson), která je součástí komerčního kitu: WT1 Profile Quant (ELN). Výsledky získané pomocí této metodiky velmi dobře charakterizují stav onemocnění. Výše hladiny exprese genu WT1 po ukončení konsolidační léčby má prognostický význam. Podle literárních údajů přetrvávající zvýšená exprese genu WT1 po zaléčení (vyšší než exprese v normální periferní krvi > 50 kopií WT1/104ABL) je spojena s vyšším rizikem relapsu. Obdobně nárůst exprese genu WT1 nad hladinu vyšší než 50 kopií WT1/104ABL - horní remisní limit (vysoké riziko molekulárního relapsu) signalizuje s vysokou pravděpodobností relaps – resp. nárůst nad výše uvedenou hladinu je potřeba potvrdit (či vyvrátit) následným, co možná nejvčasnějším odběrem primárního vzorku a jeho analýzou. Potvrzením rizika relapsu je opětovně zjištěná zvýšená hodnota exprese genu WT1 nad hladinu 50 kopií WT1/104ABL a případný pokračující trend nárůstu exprese genu WT1 v následujících odběrech (potřebných opět ve včasných intervalech). V těchto případech je důležité sledovat potencionální následný trend růstu exprese genu WT1 signalizující progresi onemocnění do klinického/morfologického relapsu. V těchto případech je indikován odběr v nejbližším možném termínu po dohodě se zadavatelem vyšetření. U pacientů s přítomností specifického markéru (fúzního genu např. PML/RAR atp.) je v těchto případech indikována aspirace kostní dřeně a následná kvantifikace specifického markéru. Výsledky exprese genu WT1 a PML/RAR či dalších specifických markérů jsou vzájemně porovnávány a konzultovány. Jako další vhodný specifický markér pro MRN (minimální reziduální nemoc) je sledování exprese mutace genu NPM1, zejména v tom ohledu, že tento markér není exprimován v periferní krvi zdravých jedinců.

Velmi důležité je dodržovat frekvenci monitorování exprese genu WT1. Doporučená frekvence je při diagnóze, po indukční terapii, po jednotlivých konsolidačních terapiích, po případné záchranné „salvage" terapii a po transplantaci souběžně se sledováním chimerismu. Vedle toho se dle výše uvedených poznatků o prognostickém významu overexprese genu WT1 by se měla analyzovat exprese genu WT1 těsně před provedením transplantace (před začátkem přípravného režimu). Dále v prvním roce minimálně 1 měsíčně a v dalších letech 4x do roka.

Co se týče sledování genu WT1 u pacientů s MDS, tak nárůst exprese genu WT1 signalizuje progresi do AML.

SOP 10:Stanovení množství transkriptů mutovaného genu NPM1 pomocí real-time RT-PCR u pacientů s AML
 

Nukleofosmin 1 (NPM1) je multifunkční fosfoprotein s tumor-supresorovou a onkogenetickou funkcí. Mutace NPM1 genu jsou uváděny jako nejčastější mutace u akutní myeloidní leukémie (AML), hlavně u AML s normálním karyotypem (NK). Mutace genu NPM1 se nevyskytuje u AML M3 (APL). Gorrelo et all. identifikoval mutace, k nimž dochází na exonu 12 v genu NPM1 jako nejvíce specifické a časté genetické poškození u dospělých a pediatrických pacientů s AML a s normálním karyotypem. Mutaci v exonu 12 v nukleofosminu (NPM1) má okolo 50% až 60% pacientů s AML s NK. Nejčastěji detekujeme mutaci typu A, kterou má okolo 80% pacientů, méně časté jsou mutace typu B a D s frekvencí okolo 9% – zbytek jsou velmi vzácné mutace (cca 2%). AML s mutovanou NPM1 má obvykle normální karyotyp, ale může mít i chromozomální aberace, jejichž význam zůstává nejasný. AML s mutovaným NPM1 s NK nebo s abnormálním karyotypem (AK) ukázal překrývající se morfologický, imunofenototypický (CD34 negativita) profil a expresi genů (down-regulace CD34 a up-regulace HOX genů). Zjištění, že AML s mutovaným NPM1 s NK nebo s AK ukázalo, že překrývání patologické, immunofenotypické a prognostické funkce má důležité diagnostické a klinické důsledky. Chromozomální aberace u pacientů s AML jsou sekundární události, jak ukazují nálezy u pacientů s AML. Na základě těchto zjištění se ukazuje že, NPM1 je primárním genetickým poškozením a že AML s mutovaným NPM1 by měly být posuzovány jako celek nezávisle na karyotypu. Ti pacienti, kteří mají mutaci NPM1, jsou charakterizováni specifickými klinickými a biologickými rysy a mají relativně dobrou prognózou v případě absence FLT3/ITD. Signifikantní nepříznivý dopad byl pozorován pouze v případě vysokého věku a u současné přítomnosti FLT3-ITD. Celkové přežití 4 roky u pacientů s mutNPM1 bez FLT3-ITD je 60%. V přežití nebyl pozorován žádný rozdíl nezávisle na NK a AK. NPM1 je klinicky významný faktor v odpovědi na léčbu a přežití. AML s mutovaným NPM1 dobře odpovídá na indukční chemoterapii. Mutace NPM1 bez FLT3-ITD je spojena s vysokým stupněm kompletní remise po konvenční indukční terapii založené na antracyklinu (Ara-C) a cytarabinu. Přítomnost mutace NPM1 je spojena s vyšší citlivostí k chemoterapii bez ohledu na přítomnost mutace FLT3-ITD. Co se týče měření počtu kopií mutovaného genu NPM1, tak nárůst jeho exprese předpovídá relaps dříve než morfologická data, či sledování molekulárního chimerismu. Medián předpovědi morfologického relapsu pomocí sledování exprese mutovaného genu NPM1 je 97 dnů předem. NPM1 mutace jsou stabilní během celého průběhu onemocnění AML - nedochází ke klonálnímu vývoji a tento fakt podporuje vhodnost použití mutovaného NPM1 jakožto vysoce specifického markéru minimální reziduální nemoci. Spolehlivé a citlivé RQ-PCR testy validované a normalizované na základě doporučení European Leukemia Net (ELN) pro mutovaný NPM1 mohou monitorovat a kvantifikovat MRN u pacientů s AML. AML s přítomností mutace v genu NPM1 je prozatímním subjektem v klasifikaci podle World Health Organization (WHO) klasifikace (revidováno v roce 2008) hematologických nádorů a nádorů lymfatických tkání.

Jako nejlepší metoda real-time RT-PCR byla vybrána metoda RQ-PCR NPM1 s kontrolním genem ABL (Abelson), která je součástí komerčního kitu: NPM1 MutaQuantTM. Výsledky získané pomocí této metodiky velmi dobře charakterizují stav onemocnění. Potvrzením rizika relapsu je opětovně zjištěná exprese mutovaného genu NPM1 a případný pokračující trend nárůstu exprese mutovaného genu NPM1 v následujících odběrech (potřebných opět ve včasných intervalech). V těchto případech je důležité sledovat potencionální následný trend růstu exprese mutovaného genu NPM1 signalizující progresi onemocnění do klinického/morfologického relapsu. V těchto případech je indikován odběr v nejbližším možném termínu po dohodě se zadavatelem vyšetření. Velmi důležité je dodržovat frekvenci monitorování exprese mutovaného genu NPM1. Doporučená frekvence je při diagnóze, po indukční terapii, po jednotlivých konsolidačních terapiích, po případné záchranné „salvage" terapii a po transplantaci souběžně se sledováním chimerismu. Dále v prvním roce minimálně 1 měsíčně a v dalších letech 4x do roka. Zadavatelé vyšetření jsou pravidelně informováni dle požadavků systému jakosti.

Technický vedoucí: Mgr. Jaroslav Polák 


Rychlý kontakt

Vedoucí Komplementu laboratoří
Tel:+420 221 977 208
Fax:+420 221 977 208

Zástupkyně vedoucího Komplementu laboratoří
Tel:+420 221 977 263

Telefonní seznam ÚHKT


Provozní doba

Ambulance
Po – Pá: 7:00–18:00

Denní nemocnice
Víkendy: 9:00–13:00

Dárci
Po – Pá: 7:00–10:30

Návštěvy
Lůžkové oddělení
Po – Pá: 13:00–18:00

JIP a Transplantační jednotka
Po – Pá: 14:00–17:00

Kudy k nám

map

Ústav hematologie a krevní transfuze
U Nemocnice 2094/1
128 20 Praha 2

Nejbližší stanice metra: Karlovo náměstí (linka B)

Nejbližší stanice tramvaje: Karlovo náměstí (10, 16, 22), Moráň (3, 6, 10, 16, 18, 24)

Nejbližší stanice autobusu: U nemocnice (291), Karlovo náměstí (176)

Jak se k nám dostanete